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二 抗

為分析二抗的使用情況,我們隨機抽取了100篇2007年或2008年發表于Science 或 Journal of Biological Chemistry雜志上的 文章(英文),這些文章涵蓋了來自于16個國家的約80個研究機構。收集的數據顯示二抗的使用非常廣泛,可以應用到幾乎所有類型的免疫檢測中,尤其是Western blot、免疫組織化學和免疫細胞化學。事實上,二抗在ELISA及流式細胞術中應用也很廣泛,不僅用于科學研究,而且廣泛的應用于臨床分析和疾病診斷。比較而言,二抗在免疫沉淀中的應用相對較少。以下內容是基于對所收集的二抗信息進行統計分析后得出的一些結論,對于您在具體的實驗中如何選擇最適合的抗體具有借鑒作用。

選擇二抗時,您必須考慮到以下因素,如一抗的物種、產生二抗的宿主、一抗的類別或亞類、二抗所耦聯的探針類型及二抗的形式(如整個IgG分子,F (ab’) 2片段,或Fab片段)等等。因此選擇哪種類型的二抗很大程度上決定于您所使用的一抗是什么,尤其針對種屬和類別而言。

通常情況下,一抗可以在山羊、小鼠、兔子、大鼠及綿羊體內制備,其中屬小鼠及兔子最為常見,相應的,二抗的種屬也應當與一抗的相一致。而對于制備二抗的宿主,則應選擇另外一種不同的動物,一般選用驢、山羊、兔子、綿羊或其他較大的動物,可以實現二抗的大規模制備,其中又屬山羊使用最多。

對于二抗類別或亞類的選擇,應遵循與一抗類別或亞類相一致的原則,其中抗IgG使用最多。這可能是因為除了五種類別的單克隆抗體外,很多一抗是多克隆抗體,屬于IgG類免疫球蛋白。此外anti-IgG可以識別幾乎所有類型?腎gG亞類,因此,在不清楚一抗是屬于那個類別或亞類的時候,anti-IgG抗體是個不錯的選擇。從我們的數據來看,值得注意的是, IgG亞類特異性的二抗(如抗IgG1, 抗IgG2, 抗IgG2a, 抗IgG2b)通常用于雙標記實驗中,包括免疫細胞化學、免疫組織化學及流式細胞術。

此外,整個IgG分子是最常用的一種二抗分子形式,而F (ab’) 2片段或Fab片段一般僅用于特殊實驗中,如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結合的情況,或需要封閉內源性免疫球蛋白的時候。

對于二抗所耦聯的探針的選擇,主要取決于具體的實驗。對于Western blot,最常用的探針是辣根過氧化酶(HRP),堿性磷酸酶(AP)的使用也很多,但不如HRP使用廣泛。此外,IRDye (如 IRDye 680、IRDye 800) and Alexa Fluor dye (如Alexa 680 ) 等系列染料也偶爾應用于 western blot當中。通過統計分析發現,來自于Amersham Biosciences、Bio-Rad、Cell Signaling、GE Healthcare Bio-Science、Jackson ImmunoResearch Laboratories、LI-COR Biotechnology、Pierce Biotechnology、Santa Cruz Biotechnology、Sigma 及 Zymed Laboratories公司的HRP標記的二抗在Western blot中均有廣泛使用;而對于AP標記的二抗,您可以選擇Jackson ImmunoResearch Laboratories、Sigma、Bio-Rad 及DAKO公司。

對于免疫熒光檢測實驗(包括免疫細胞化學及免疫組織化學),應用最廣泛的是耦聯有Alexa Fluor系列染料的抗體(如Alexa Fluor 488, 546, 568, 594, 596, 647, 633)、花青染料(Cyanine)系列標記的抗體(如Cy2, Cy3, and Cy5)、FITC及羅丹明(Rhodamine)。其中對于Alexa Fluor標記的二抗,推薦選擇Invitrogen 公司或Molecular Probes公司(現屬于Invitrogen公司),是著名的生產Alexa Fluor染料的公司。從我們收集的數據來看,Jackson Immunoresearch Laboratories公司的花青染料(Cyanine)系列標記的二抗使用較多,而對于FITC,Jackson Immunoresearch Laboratories、Santa Cruz Biotechnology、DAKO 及Sigma公司均可選擇。Bio-Rad、Chemicon、Invitrogen或Sigma公司的羅丹明標記的二抗使用較好。另外,如果你想放大檢測信號,你可以選擇生物素標記的二抗,Jackson Immunoresearch Laboratories、Vector Laboratories 或R&D Systems均是不錯的選擇。

對于流式細胞術,FITC是選用最多的標簽,PE標簽也可以使用。

對于ELISA實驗,HRP 和 AP標簽使用最多。

在免疫沉淀中,二抗的使用并不是很多,但偶爾也有使用,如用于蛋白的分離,一般選擇無耦聯標記的二抗。

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